Je dois préparer un TP d'enzymologie et j'ai un petit problème. Le but est d'étudier les paramètres cinétiques de la bêta-galactosidase, on prend un substrat et on forme du produit après hydrolyse, ce produit absorbe à 420nm et est donc jaune. Donc on applique Beer-Lambert etc.
Un moment donné on me demande de tracer la courbe de la vitesse (c'est-à-dire si j'ai bien compris le nombre de mol de produit formé par minute) en fonction de la concentration en substrat initial. La courbe de Mickaelis montre qu'à partir d'une certaine concentration de substrat la vitesse n'évolue plus et tend vers une asymptote qui est la vitesse maximale.
Dans le cadre de mon TP j'ai dû déterminer auparavant la période de temps en minutes durant laquelle la libération de produit est proportionnelle au temps de réaction, c'est-à-dire la partie linéaire de la courbe sur le graphique absorbance en fonction du temps de réaction. J'ai fait ça en disant que cette période correspond à la partie linéaire de la courbe qu'on représente en traçant l'absorbance en fonction du temps de la réaction. En effet logiquement au bout d'un certain temps et pour une concentration fixée de substrat, tout le substrat sera consommé et l'absorbance sera maximale et ne bougera plus, ça fera un plateau et ce n'est plus linéaire. Donc la période de temps c'est normalement bien le temps nécessaire pour que la réaction se fasse entièrement. Vient donc ensuite cette question où on me demande de tracer la vitesse en fonction de la concentration en substrat.
Pour cela j'ai 7 tubes et dans chaque tube je mets des concentrations différentes du substrat et un tampon ph 7. Le tout à 37°C et je mets 1mL de l'enzyme partout. J'arrête la réaction au bout du temps en minutes déterminé précédemment et je lis l'absorbance à 420nm (c'est le produit formé qui absorbe).Je dois donc tracer l'absorbance en fonction de la concentration en substrat (aussi demandé) et c'est là que je bloque. Je sais que je dois utiliser l'absorbance pour faire le lien avec la vitesse, l'absorbance me donnera une concentration de produit formé grâce à une gamme étalon. Si la réaction dure par exemple 20 minutes je devrai diviser la concentration par 20 pour l'avoir par minute, et ça c'est la vitesse (= nombre de mol de produit apparu par minute). Je fais ça pour chaque concentration initiale en substrat des 7 tubes.
Le problème c'est que comme l'absorbance augmentera toujours avec la concentration initiale en substrat alors forcément la vitesse augmentera toujours en fonction de la concentration initiale en substrat (selon la relation vitesse = concentration en produit formé / nombre de minutes). En effet plus la concentration en substrat initial sera grande et logiquement plus la concentration en produit formé augmentera toujours plus. Et ça donnera alors une vitesse toujours plus grande. Or l'allure typique de la courbe de Mickaelis Menten est une vitesse qui est à peu près constante au bout d'une certaine concentration en substrat, comme dit précédemment avec l'asymptote. Donc je dois me tromper quelque part dans mon raisonnement ?
Voilà j'espère que le pavé n'était pas trop lourd. Merci d'avance de votre aide.
PS : je n'ai pas encore fait le TP mais je ne fais que le préparer, je n'ai donc aucune mesure expérimentale mais j'essaye d'appréhender certaines questions avant. Si ça se trouve certains de mes raisonnements ne sont pas corrects.
Une courbe de Vitesse généralement c'est X(t) pas v(t) non ? Quantité de matière en ordonnée et temps en abscisse ?
Car la vitesse sur un graphique ça s'obtient pas en mettant la vitesse directement sur l'un des deux axes, On la visualise car elle est décomposé ? J'dis peut-être des conneries...
Après je sais qu'en cinétique on calculer la Vitesse volumique de type : v = 1/V(dx/dt) Avec grand V volume. et x quantité de matière.
- Edité par Blackline 1 octobre 2014 à 4:33:21
Zéro pointé à vie. | La chimie est l'écoute de la matière. | Art&Science.
Une courbe de Vitesse généralement c'est X(t) pas v(t) non ? Quantité de matière en ordonnée et temps en abscisse ?
Non pas forcément ça peut être v(C) comme on lui demande ici.
Craw a écrit:
Le problème c'est que comme l'absorbance augmentera toujours avec la concentration initiale en substrat
Et non, c'est avec la concentration en produit formé que l'absorbance augmente, pas avec la concentration initiale
alors forcément la vitesse augmentera toujours en fonction de la concentration initiale en substrat (selon la relation vitesse = concentration en produit formé / nombre de minutes). En effet plus la concentration en substrat initial sera grande et logiquement plus la concentration en produit formé augmentera toujours plus.
Bah non, tu te limite dans le temps et comme tu l'a dis, à une certaine concentration, la vitesse est constante ... comment dire ... si tu prends une deux CV et une Ferrari et que tu les lance à la même vitesse, au bout de 10 minutes elles auront parcourue la même distance, pourtant la Ferrari a un plus gros moteur à la base. Bah là c'est pareil, si tu atteins une vitesse limite pour le haut de ta gamme, les tubes qui auront cette vitesse de réaction auront la même absorbance au bout d'un temps défini (sauf si ce temps est trop long et que la réaction a le temps de se finir dans certains tube)
Au final, si tu as quelques tubes qui ont une concentration supérieure à celle qui donne la vitesse limite, tu devrait te retrouver avec une courbe qui correspond à l'équation de michaelis-menten
"Et non, c'est avec la concentration en produit formé que l'absorbance augmente, pas avec la concentration initiale"
Oui je le sais mais la concentration en produit formé dépend bien de la concentration initiale en substrat, plus tu en mets plus au départ plus tu pourras former de produit, donc l'absorbance augmentera. Jusqu'à une limite pour retomber sur la courbe de Mickaelis (mais moi je n'ai pas cette limite voir ci-dessous).
"Bah non, tu te limite dans le temps et comme tu l'a dis, à une certaine concentration, la vitesse est constante ... comment dire ... si tu prends une deux CV et une Ferrari et que tu les lance àla même vitesse, au bout de 10 minutes elles auront parcourue la même distance, pourtant la Ferrari a un plus gros moteur à la base. Bah là c'est pareil, si tu atteins une vitesse limite pour le haut de ta gamme, les tubes qui auront cette vitesse de réaction auront la même absorbance au bout d'un temps défini (sauf si ce temps est trop long et que la réaction a le temps de se finir dans certains tube)
Au final, si tu as quelques tubes qui ont une concentration supérieure à celle qui donne la vitesse limite, tu devrait te retrouver avec une courbe qui correspond à l'équation de michaelis-menten"
C'est ce à quoi j'avais pensé hier, exactement la même chose mais il y avait encore un problème et je vais dire pourquoi. Je n'ai pas voulu le mettre dans mon premier message sinon ça faisait trop long.
Dans la 1ère partie où il faut déterminer le temps de la réaction j'utilise 20mL de tampon ph 7, 20mL de substrat à 10^-2mol/L et 20mL d'enzyme, disons il faut 20 minutes pour que la réaction se fasse entièrement (on m'a demandé de déterminer le temps où la libération de produit est proportionnelle au temps de réaction, si j'ai bien compris c'est équivalent au temps qu'il faut pour que toute la réaction se fasse "en langage simple" ? ).
Dans la 2ème partie où j'étudie vraiment la réaction, je la fais donc durer aussi 20 minutes. Sauf que j'utilise des concentrations différentes de substrat mais avec seulement 1mL de tampon, 1mL de substrat (au maximum, minimum 0mL, j'ai 7 tubes) et 1mL d'enzyme. Ce qui fait que la concentration de substrat sera toujours inférieure à celle utilisée en première partie. Pourtant si la réaction a eu le temps de se faire entièrement en première partie avec une plus grande concentration de substrat c'est donc qu'elle aura toujours le temps de se faire en deuxième partie. Et donc il y aura toujours plus de produit formé en fonction de la concentration initiale en substrat, donc toujours plus d'absorbance et toujours une plus grande vitesse.
si j'ai bien compris c'est équivalent au temps qu'il faut pour que toute la réaction se fasse "en langage simple" ? ).
Non, c'est plutôt le temps au quel tu arrives à une vitesse constante (la réaction ne se met pas tout de suite à sa vitesse de croisière). Si tu mesure l'absorbance toutes les minutes et qu'a chaque fois tu calcul de combien elle a monté, à un moment donné, tu retombera toujours sur la même valeur, et c'est le temps écoulé au premier point de cette série de différences identiques qu'on te demande. Au début tu auras une grosse variation d'absorbance qui va diminuer jusqu'à devenir constante puis deviendra rapidement nulle quand tu arriveras à l'équilibre (je parle de la variation, pas de l'absorbance elle même hein). En gros, ça serait donc le temps que tu devrait laisser réagir avant de commencer tes mesures pour la suite.
Pour ce qui te gêne ensuite : qui te dis que la réaction se fait en 20 minutes ? peut être qu'il faut trois heures pour arriver à l'équilibre. parce que du coup, la première partie si tu as mal compris la question c'est pas le temps pour arriver à l'état final qu'on te demande. (c'est bien "le temps où la libération de produit est proportionnelle au temps de réaction" qu'on te demande ?)
"En gros, ça serait donc le temps que tu devrait laisser réagir avant de commencer tes mesures pour la suite."
Mais on me dit de laisser agir la réaction durant ce temps justement, donc si je laisse agir pendant ce temps et qu'ensuite j'arrête la réaction je ne peux pas commencer les mesures.
"c'est bien "le temps où la libération de produit est proportionnelle au temps de réaction" qu'on te demande ?"
Oui.
Comme je dois tracer un graphe absorbance en fonction du temps de réaction et un deuxième graphe concentration en produit (apparu) en fonction du temps j'ai pensé que c'était la partie linéaire de la courbe de ces deux graphes, car c'est une fonction linéaire (cas de proportionnalité). Mais apparemment il y a aussi un deuxième cas, celui où l'absorbance ne varie pas de la même façon chaque minute (et donc ce serait la partie de la courbe à ne pas prendre comme tu dis). Moi j'avais en tête uniquement un cas où l'absorbance varie pareil chaque minute depuis le début de la réaction jusqu'à se stabiliser pour former un plateau (quand tout le produit est apparu). Mais oui il y a deux cas possibles.
20 minutes c'était un exemple, je n'ai pas encore fait le TP.
Donc c'est bien ce que je pense, on ne te demande jamais d'attendre la fin de la réaction.
En fait, tu verras que la courbe l'absorbance/concentration en produit en fonction du temps et un peu plate au début, ça fait un S. pour mesurer la vitesse, il faut donc que tu soit dans la partie linéaire de cette courbe. Ensuite, t'as pas besoins de beaucoup de point pour calculer la vitesse, tu prends 2 point après le temps ou la réaction s'initie et avant qu'elle se finisse (faut pas attendre trop non plus) et ça devrait suffire.
Après je ne comprends du coup pas plus de toi pourquoi on demanderai de arrêter moment ou la vitesse se stabilise ? Ou alors il me manque un bout important de l'énoncé sur cette partie ^^'
Je vois, j'étais complètement à côté de la plaque alors car je n'ai pas du tout fait tout ça moi en préparant le TP (ou du moins en essayant).
Le mieux à faire je pense c'est d'attendre de l'avoir fait et de relire ce topic, et si j'ai encore des problèmes je repasserai. Parce que là j'ai essayé de prédire des résultats mais apparemment ce n'est pas du tout ce à quoi je pensais, pourtant ça me semblait logique tout ce que j'ai fait.
"Après je ne comprends du coup pas plus de toi pourquoi on demanderai de arrêter moment ou la vitesse se stabilise ? Ou alors il me manque un bout important de l'énoncé sur cette partie ^^'"
Je n'ai pas tout mis oui, loin de là, juste le plus important. Mais après ça doit être moi qui interprète comme ça alors que ce n'est pas ça qui est demandé. Le but final c'est de déterminer Km et Vm sans inhibiteur pour le premier TP. Je dois le faire avec la méthode de la double inverse en représentant 1/v en fonction de 1/concentration initiale en substrat mais ça je sais le faire une fois que j'ai la courbe v en fonction de la concentration initiale en substrat.
Bon j'ai un peu avancé sur ce TP et je suis arrivé à la deuxième partie. Dans cette deuxième partie j'utilise toujours la même enzyme mais avec un inhibiteur : le maltose. J'observe un type d'inhibition compétitive, le substrat synthétique de la bêta-galactosidase utilisé en TP est l'orthonitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (ONPG) et je me demandais tout simplement si le type d'inhibition observé ne pouvait pas s'expliquer par le fait que le maltose (contenant deux glucose reliés entre eux en alpha 1->4) ressemble d'un point de vue chimique à l'ONPG (il y a un galactose dedans).
Autrement dit je voudrais savoir s'il est correct de dire que le glucose (présent dans le maltose) est un analogue structural du galactose (présent dans l'ONPG) et que du coup le maltose empêche la fixation de l'ONPG sur le site actif de la bêta-galactosidase, d'où le type d'inhibition observé (compétitif). En effet le galactose est un épimère en C4 du glucose, donc ils se ressemblent normalement.
Ok merci. Bon après vu que mon raisonnement semble correct une autre question m'est venue spontanément à l'esprit. Puisque in-vivo dans les cellules il y a la bêta-galactosidase et du glucose aussi, donc pourquoi le glucose n'agit pas sur la bêta-galactosidase en l'inhibant ? Je pense que in-vivo ce n'est pas pareil mais bon.
J'ai également une deuxième question sur les vitesses de réaction sans et avec l'inhibiteur. Je dois tracer les vitesses en fonction de la concentration en substrat de l'enzyme (soit l'ONPG) pour 7 tubes (de concentrations en substrat croissantes). Vmax est inchangé, seul Km change (d'où l'inhibition compétitive), cependant les vitesses de réaction diminuent en présence de l'inhibiteur, pour qu'on puisse expliquer que Vmax reste malgré tout inchangé ça doit donc faire une courbe du genre :
La vitesse v est reliée par l'absorbance via la relation v = concentration en produit/x minutes = (A/epsilon)/x minutes. Sans inhibiteur la réaction tournait pendant 3 minutes 30. Avec inhibiteur elle tournait pendant 7 minutes pour tous les tubes. En gros pour chaque tube on détermine une vitesse de transformation du substrat et donc d'apparition du produit coloré (d'où l'absorbance mesurable) pour 1 minute. Sans inhibiteur on a une progression plus rapide vers la vitesse maximale, c'est-à-dire que même si on rajoute plus de substrat après il n'aura pas le temps d'être consommé donc toujours même quantité de produit libéré donc toujours même absorbance donc toujours même vitesse d'où l'asymptote horizontale. Avec inhibiteur la courbe est toujours sous la courbe sans inhibiteur et on atteint Vmax moins rapidement, il faut plus de substrat pour atteindre Vmax.
Est-ce que cela peut s'expliquer par le fait que sans inhibiteur la constante de dissociation Km soit moins élevée que pour le cas avec inhibiteur et donc le substrat est plus fortement lié à l'enzyme (complexe ES) et donc davantage transformé en une minute par rapport au cas avec inhibiteur ? Ce qui expliquerait pourquoi même avec des concentrations égales en substrat (point en abscisse donné) moins de substrat a le temps d'être transformé en une minute par l'enzyme avec inhibiteur. Et permettrait aussi d'expliquer pourquoi une plus forte concentration en substrat est nécessaire pour atteindre Vmax dans le cas avec inhibiteur.
Ok merci. Bon après vu que mon raisonnement semble correct une autre question m'est venue spontanément à l'esprit. Puisque in-vivo dans les cellules il y a la bêta-galactosidase et du glucose aussi, donc pourquoi le glucose n'agit pas sur la bêta-galactosidase en l'inhibant ? Je pense que in-vivo ce n'est pas pareil mais bon.
In vivo c'est assez simple, il n'ya pas de beta-galactosidase (ou très peu, en fait) (EDIT !) si n'importe laquelle des deux conditions suivantes est vérifiée :
il y a une source de carbone réduit "simple" (glucose, typiquement)
il n'y a pas de lactose dans le milieu
(cf opéron lactose, en tout cas, pour les bactéries. Chez les Mammifères, ce serait différent). À ce propos, je trouve que c'est assez étrange que le maltose inhibe de façon compétitive l'enzyme, censée être ultra spécifique sur les galactoses condensés par liaison beta à n'importe quoi d'autres (d'où son nom). Enfin bon, si les résultats sont là c'est que ça doit être ça mais ça m'interloque un peu. Je me renseignerais là-dessus. (ou peut-être que la maltose est capable de se fixer sur l'enzyme mais pas le glucose seul, ce qui est possible aussi. Les enzymes ont quand même une sacrée spécificité, mêmes sur des stéréoisomères !).
Dans le modèle des inhibitions compétitives, c'est très simple : Km est une constante, elle est inchangée, même avec des inhibiteurs. Mais avec inhibiteurs, tu "délocalises la réaction" et déplace l'équilibre : il y a formation de complexe EI à partir de E et de I, (enzyme et inhibiteur), donc la concentration en enzyme décroît, donc par loi d'action de masse l'enzyme a une plus forte tendance à se dissocier. Il en résulte que tout se passe comme si l'enzyme avait une constante d'affinité \( Km' = Km \times ( 1 + \frac{[I]_0}{K_I}) \) où [I]0 désigne la concentration initiale en inhibiteurs et Ki la constante de dissociation du complexe enzyme inhibiteur (le Km de l'enzyme pour l'inhibiteur, quoi). Cf modèle de Michaelis-Menten et de l'inhibition compétitive, tu dois avoir ça quelque part dans tes cours, ou dans les cours qui viendront.
Tu peux noter que cette valeur est parfaitement compatible avec celle sans inhibiteur : si [I]0 tend vers 0, Km' tend vers Km.
Maintenant, quand tu satures ta solution en substrats, la probabilité pour l'enzyme de rencontrer un inhibiteur plutôt qu'un substrat devient quasi nulle, donc même si l'affinité semble abaissée, toujours par les jeux d'actions de masse et d'équilibres, la quantité d'enzymes inhibiées devient ridicule par rapport à celle d'actives, donc on retombe sur nos pattes et sur Vmax.
Je vois. Donc s'il y a du lactose mais du glucose dans l'environnement proche la bêta-galactosidase n'hydrolysera quand même pas le lactose (ou très peu) du fait de son inhibition par du glucose ? Dans le cas où le glucose seul inhibe aussi l'enzyme comme le maltose bien entendu.
Pour la suite c'est ce à quoi j'avais pensé et qui me semblait aussi bizarre, normalement il aurait fallu que ce soit un inhibiteur contenant un galactose pour qu'on puisse expliquer ça comme ça, le glucose est assez proche du galactose mais quand même différent au niveau du carbone anomérique (alpha et ici l'enzyme reconnaît des bêta-galactosides), mais apparemment ce serait correct, j'ai demandé. Je ne pense pas non plus que le motif doit être strictement identique mais une analogie structurale assez prononcée pourrait être suffisante peut-être, ici ce qui change c'est uniquement l'orientation du C4 et le carbone anomérique.
"Dans le modèle des inhibitions compétitives, c'est très simple : Km est une constante, elle est inchangée, même avec des inhibiteurs. "
J'ai le contraire. Dans les inhibitions compétitives Km augmente (ce qui est logique, le substrat se dissocie plus de l'enzyme) et c'est Vm qui est inchangé. Ou bien je n'ai pas compris ta réponse c'est possible.
"Maintenant, quand tu satures ta solution en substrats, la probabilité pour l'enzyme de rencontrer un inhibiteur plutôt qu'un substrat devient quasi nulle, donc même si l'affinité semble abaissée, toujours par les jeux d'actions de masse et d'équilibres, la quantité d'enzymes inhibiées devient ridicule par rapport à celle d'actives, donc on retombe sur nos pattes et sur Vmax."
Je crois que je commence à mieux saisir la chose, mon cours dit "c'est le seul type d'inhibition à pouvoir être levé par l'augmentation de la concentration en substrat" et ici je vois qu'on retombe bien sur le Vmax quand justement on augmente la concentration en substrat, donc on retrouve l'intégralité des paramètres cinétiques de l'enzyme déterminés auparavant sans inhibiteur. Je crois que c'est cette partie du cours qui rejoint ta phrase.
Mais finalement en gros je voulais juste savoir pour mes deux courbes, pour un point en abscisse donné et donc une concentration en substrat donnée, la même pour les deux cas : pourquoi l'enzyme sans inhibiteur transforme moins de substrat en produit que l'enzyme avec inhibiteur en une minute ? C'est dû au fait que Km est plus grand avec inhibiteur et donc le substrat a moins d'affinité pour l'enzyme et est moins transformé ? Cette justification est correcte ?
Le reste j'ai compris avec les formules, Km' c'est une sorte de Km que l'on détermine après action de l'inhibiteur si j'ai bien compris ? Par exemple si [I]0 augmente alors ça donnera Km'=x.Km, x un nombre positif, ce qui voudra dire que le Km' est plus élevé que le Km donc après action de l'inhibiteur l'enzyme se dissocie plus de son substrat, ça reste logique mais peut-être que j'interprète mal.
Je vois. Donc s'il y a du lactose mais du glucose dans l'environnement proche la bêta-galactosidase n'hydrolysera quand même pas le lactose (ou très peu) du fait de son inhibition par du glucose ? Dans le cas où le glucose seul inhibe aussi l'enzyme comme le maltose bien entendu.
Si tu travailles avec des bactéries (ce qui est généralement le cas en TP), si tu poses tes bactéries sur un milieu contenant glucose et lactose, il y aura très peu de synthèse de beta-gal et donc on ne pourrait que difficilement repérer la consomation de lactose. (Mais l'enzyme restante dans la bactérie est suffisante pour des réactions avec le marqueur X-gal, si jamais tu l'utilises aussi ; et aussi pour la réaction avec l'ONPG si tu l'extraies "proprement"). Après, si l'inhibition de l'enzyme par le glucose est vérifiée, la réaction sera juste plus lente mais on la verra quand même.
Pour la suite c'est ce à quoi j'avais pensé et qui me semblait aussi bizarre, normalement il aurait fallu que ce soit un inhibiteur contenant un galactose pour qu'on puisse expliquer ça comme ça, le glucose est assez proche du galactose mais quand même différent au niveau du carbone anomérique (alpha et ici l'enzyme reconnaît des bêta-galactosides), mais apparemment ce serait correct, j'ai demandé. Je ne pense pas non plus que le motif doit être strictement identique mais une analogie structurale assez prononcée pourrait être suffisante peut-être, ici ce qui change c'est uniquement l'orientation du C4 et le carbone anomérique.
Honnêtement j'en sais peu là-dessus, tout ça c'est très possible. De toutes façons ce qui compte ce sont les résultats expérimentaux, si tu as une inhibition compétitive d'après eux c'est qu'il y en a bien une.
J'ai le contraire. Dans les inhibitions compétitives Km augmente (ce qui est logique, le substrat se dissocie plus de l'enzyme) et c'est Vm qui est inchangé. Ou bien je n'ai pas compris ta réponse c'est possible.
Ce que je voulais dire, c'est qu'il faut bien comprendre que Km est une constante thermodynamique de l'équilibre E + S = ES. Elle est inchangée, c'est une constante. En revanche, en rajoutant un inhibiteur, on fait apparaître une nouvelle réaction et donc un nouvel équilibre sous constante Ki. Km reste inchangée, mais comme [E] diminue par le second équilibre, l'état final est changé (et notamment la concentration en [ES] diminue).
On montre ensuite que coupler ces deux équilibres est équivalent à ne réaliser qu'une seule réaction, plus facile à étudier donc, la réaction E + S = ES sous constante d'équilibre Km' > Km avec Km' = f (Km, [I]0, Ki) . L'affinité de l'enzyme pour son substrat est amoindrie, il y a moins de complexes ES donc même si l'enzyme est fonctionnelle, puisque [ES] diminue, la vitesse de réaction est abaissée pour une même concentration en substrat. Et si tu représentes ta courbe V0 = f ( [S]0), tu trouveras bien un "Km' > Km".
Mais finalement en gros je voulais juste savoir pour mes deux courbes, pour un point en abscisse donné et donc une concentration en substrat donnée, la même pour les deux cas : pourquoi l'enzyme sans inhibiteur transforme moins de substrat en produit que l'enzyme avec inhibiteur en une minute ? C'est dû au fait que Km est plus grand avec inhibiteur et donc le substrat a moins d'affinité pour l'enzyme et est moins transformé ? Cette justification est correcte ?
Je suppose que c'est une faute de frappe mais l'enzyme sans inhibiteur transforme bien plus de réactifs en produits par minute que l'enzyme avec inhibiteur . La réponse est juste au-dessus : moins de complexe ES à cause de la dissociation avec inhibiteurs, or \( v = k_{cat}[ES] \) avec \(k_{cat}\) constante (mais dépend de la température ! et à déterminer parfois) donc vitesse abaissée.
Merci pour ta réponse précédente. Depuis je me suis lancé dans la rédaction du compte-rendu et j'ai 2 nouvelles questions :
1) Quelle est vraiment l'unité des vitesses enzymatiques en ordonnée (le graphe de Mickaëlis où je mets les vitesses en ordonnée en fonction des concentrations de substrat en abscisse) ? Est-ce des mol/L/min ou simplement des mol/min ? Car des fois je rencontre mol/min et des fois mol/L/min... J'ai fait l'analyse dimensionnelle et comme la vitesse est égale à la concentration divisée par x minutes (le temps de la réaction) alors normalement c'est bien des mol/L/min mais on ne sait jamais.
Pour finir si c'est bien ça l'unité UI correspond donc à micromole/L/min ? Des fois je rencontre aussi micromole/min tout simplement.
2) Avec le graphe de Mickaëlis on m'a dit qu'il était possible de déterminer graphiquement Vmax (l'asymptote horizontale à la courbe) et Km, la projection du point d'ordonnée Vmax/2 en abscisse. Mais on m'a dit que ce n'était pas du tout précis et qu'il fallait d'abord faire la méthode de linéarisation pour avoir Km et Vmax avec le calcul. Ma question c'est est-ce qu'il est correct de déterminer Vmax et Km d'abord graphiquement sur la courbe de Mickaëlis et ensuite de dire "normalement Km et Vmax doivent être peu différents de ceux déterminés graphiquement lorsque nous le ferons avec la méthode de linéarisation". Je dis ça car des fois j'ai un Vmax graphiquement de 14 UI par exemple et après par le calcul j'ai eu 22 UI dans un exercice, pourtant l'asymptote horizontale montrait bien 14 UI graphiquement en ordonnée. Et la courbe ne montait donc plus. Même allure que celle plus haut sur ce topic en gros. Bizarre non ?
Par contre je ne peux toujours pas dire qu'avec un inhibiteur Km augmente ? Car Km' c'est le Km après ajout de l'inhibiteur, c'est pareil juste une question de langage non ?
Une vitesse enzymatique s'exprime (normalement) en mol/L/min : une évolution de la concentration en produits au cours du temps, c'est la définition même de la vitesse enzymatique : \( v = \frac {d[P]}{dt} \) . Ensuite parce que comparer deux évolutions de vitesses initiales en mol/min ça n'a pas de valeur significative, ça dépend du volume de la cuve si tu fais de la spectrophotométrie / du volume réactionnel si c'est par conductimétrie/pH-métrie/n'importe quoi d'autre. En l'occurrence tu me diras c'est tout par la même méthode donc ça ne change a priori pas trop, mais si jamais tu devais comparer des résultats obtenus par différentes méthodes, c'est impératif.
ce que c'est que l'UI : normalement oui. Et comme en enzymo chacun a tendance à exprimer ses résultats avec sa propre unité (µmol/L/min ou nano mol parfois ou mmol ou en katal, tant qu'à faire...) le mieux est encore de bien suivre le protocole et de se fixer une unité. En tout cas normalement c'est en quantité de matière par volume et par temps.
Oui, le graphe peut théoriquement te donner cette info. Sauf que comme tu l'as remarqué, le graphe est loin d'être une droite. Le problème c'est que la seule chose qu'on puisse raisonnablement exploiter, c'est une droite. Parce que si tu lis la valeur pour laquelle V = Vmax/2 alors en théorie tu l'as, sauf qu'il te faut une précision assez incroyable sur cette zone de la courbe pour pouvoir l'étudier. Et si tu traces à l'ordinateur, il va te lisser la courbe à sa manière qui n'est pas celle de la valeur réelle. Bref, c'est complètement biaisé. T'auras l'ordre de grandeur, mais après, l'imprécision sera monstrueuse....
C'est pour ça que c'est impératif, quel que soit la situation étudiée au passage, de se ramener à une droite. Ici, méthodes des doubles inverses, de Eadie-Hoffset (à l'orthographe près ) ou autre, celle que tu préfères (ou qu'on t'impose...) du moment que t'as une belle droite avec des coefficients de corrélation corrects (à toi de choisir quelle incertitude t'es prêt à accepter pour travailler).
Pour l'histoire des Km, je pointais du doigt le fait qu'il faut bien comprendre ce qu'il se passe quand on dit que Km augmente. Bien sûr que tu peux le dire, à condition d'être capable d'expliquer ce que ça signifie. Si on te demande une explication précise du rôle de l'inhibiteur, expliquer pourquoi on peut dire que Km' augmente.
Ok j'ai compris pour l'unité, ça confirme donc ce que je pensais.
Pour le graphe en fait dans un exercice j'ai vu que l'ordonnée se finissait à 14 UI. Donc graphiquement j'aurais dit Vmax = 14 UI. Sauf qu'après quand je suis passé par la méthode de linéarisation j'ai trouvé 22 UI ! Soit Vmax/2 = 11 et non plus 7, c'est même pire qu'une imprécision en fait non ?
Pour justifier ça et le fait qu'on ne peut pas déterminer Vmax (et donc Vmax/2 et donc Km) avec la courbe de Mickaëlis, est-ce qu'il est correct de dire que c'est parce que Vmax correspond à la vitesse initiale théorique maximale de la réaction obtenue pour une concentration infinie en substrat et que donc comme en abscisse la concentration n'est pas infinie (impossible expérimentalement) alors c'est normal qu'on ne voit pas la courbe monter jusque 22 UI en ordonnée. Mais que si on représentait le graphe avec une très grande échelle en abscisse (pour avoir des concentrations très grandes) alors on verrait la courbe tendre vers 22 UI en ordonnée (qui est le vrai Vmax). Je veux dire en abscisse j'ai maximum 5*10^-3mol/L par exemple et il faudrait représenter jusqu'à une concentration infinie pour avoir le point en ordonnée correspondant à Vmax.
Du coup même si la courbe semble faire un plateau à 14 UI en fait elle continuerait de monter très lentement jusque 22 UI, ce qu'on ne voit pas sur le graphe car on arrête les concentrations trop tôt.
Si l'explication est bien la bonne alors je pense faire la méthode en double inverse (celle imposée et celle que je préfère aussi) et ensuite je vais trouver un Vm et un Km, puis je pourrai retourner sur la courbe de Mickaëlis pour vérifier que le Vmax correspond effectivement et permet de retomber sur le Km. Car au départ je voulais faire l'inverse, j'ai dit que j'allais d'abord déterminer graphiquement Vmax et Km avec la courbe de Mickaëlis puis j'ai dit "ensuite nous ferons la méthode de linéarisation et nous devrons retomber sur des valeurs plus ou moins proches de Vm et Km que celles déterminées graphiquement avec la courbe de Mickaëlis" mais apparemment la courbe de Mickaëlis ne permet pas du tout de déterminer Km et Vm.
En gros linéarisation en premier pour avoir Vm et Km et courbe de Mickaëlis en deuxième pour confirmer les résultats de la linéarisation c'est possible mais pas l'inverse, c'est bien ça ?
"Si on te demande une explication précise du rôle de l'inhibiteur, expliquer pourquoi on peut dire que Km' augmente."
Pour l'expliquer je pense utiliser ta formule (elle est aussi dans mon cours) puis remarquer que seul [I]0 varie et augmente (la concentration en inhibiteur) donc Km' augmente (car [I]0 est au numérateur). Ensuite je donne l'explication biologique, en gros un Km plus grand = une constante de dissociation plus grande pour l'enzyme vis-à-vis de son substrat = l'enzyme a moins d'affinité pour le substrat = moins de complexes ES, ensuite j'utilise la formule avec le kcat et je dis que [ES] diminue donc la vitesse de la réaction aussi.
Après je peux comparer avec le TP 1 (sans inhibiteur) puis dire que [I]0 = 0 donc on a Km'=Km, le Km est inchangé.
Effectivement le Vmax est une grandeur théorique (et donc inatteignable) mais si \( [S]_0 \gg K_m \) (typiquement \( [S]_0 \ge 10 K_m\) ) on a \(v \aprox v_{max}\) (ça se démontre bien par le calcul). Sauf que de mémoire de TP le Km de l'enzyme est voisin de 5 mmol/L ; ça dépend évidemment du matériel biologique que tu as utilisé mais c'est l'idée. Donc effectivement si tu ne peux pas dépasser cette valeur tu pourras pas observer Vmax.
t'aurais atteint 50 mmol/L que ça aurait pu se voir, seulement l'ONPG ça coûte plus ou moins cher et c'est plus ou moins toxique donc on fait avec ce qu'on a .
Justement j'ai exactement 5 mmol/L d'ONPG mais c'est mon dernier tube, le plus concentré en ONPG donc tout à droite sur l'axe des abscisses qui représente les concentrations en substrat. Donc normal que je ne puisse pas déduire Vmax avec la courbe de Mickaëlis ok c'est bien ce que je pensais.
Du coup sur ma courbe de Mickaëlis si c'est 5 mmol/L le Km environ (je verrai si j'ai ça) ça veut dire que le point en ordonnée Vmax/2 se projettera tout à la fin de mon axe des abscisses, habituellement c'est plutôt au milieu, ça fera un truc bizarre mais ce n'est pas très grave je pense ?
Du coup j'ai vu en prenant comme valeur de référence 5 mmol/L pour le Km que ça correspond à une vitesse de 1,3 umol/L/min (1,3 UI et donc 1,3 UI = Vmax/2). Cela signifie que Vmax vaudrait 2,6 UI ? J'imagine que ça dépend des cas mais j'espère ne pas m'être planté complètement quoi.
Rectification : après consultation de différents documents, il semblerait que le Km pour l'ONPG soit extrêmement variable, de 0.15 mmol (http://lgcorneille-lyc.spip.ac-rouen.fr/sites/lgcorneille-lyc.spip.ac-rouen.fr/IMG/pdf/DS309B.pdf et http://perrin33.com/polys/protein/tp-betagal-initiation-michaelis.pdf ) à 15 mmol/L (http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jf4008554). ( (Et ça donne des infos sur le rôle inhibiteur du glucose, par la même occasion). Bref, termine tes calculs et regarde si au moins le Km est cohérent avec l'absence de plateau sur ton graphe (sinon y'a une belle couille dans le pâté !). Tout ça pour dire que ton résultat est juste "imprévisible" et qu'il ne faut pas avoir peur d'avoir raté ! (désolé si je t'ai fait peur avec mon 5mM), et il est fort probable que si tu fais ta linéarisation correctement tu tombes sur des résultats normaux ou au moins cohérents.
Et pour la projection de Vmax/2 : ça peut tomber à peu près n'importe où su l'axe des abscisses, mais si tu traces le graphe complet jusqu'au plateau de saturation normalement c'est plutôt collé à l'axe des ordonnées ; comme tu ne dois avoir qu'une partie de ce graphe forcément ça décalle tout mais si le graphe était complété ça tomberait même plutôt bien "à gauche".*
Pour la valeur de Vmax ; cf au dessus, ça doit varier énormément ( d'autant que comme ça dépend de la concentration en enzymes tu n'as aucun moyen de comparer a de quelconques valeurs de référence). regarde donc ce que ça donne.
Ok par contre je viens de m'apercevoir que j'ai un autre problème plus embêtant.
Pour le TP 2 où j'utilise l'inhibiteur je vois que mes vitesses pour chacun des 7 tubes augmentent au lieu de diminuer par rapport au TP 1 sans inhibiteur. Normalement elles devraient diminuer et Vmax au total inchangé (jusqu'il sera atteint pour une plus grande concentration en substrat, cf la courbe au-dessus).
Donc je ne comprends pas pourquoi les vitesses augmentent même si j'ai une hypothèse : dans le TP 1 on utilise l'enzyme à 50mg/L, dans le TP 2 à 75mg/L, est-ce que l'augmentation de vitesse est donc due à une plus grande concentration de l'enzyme pour le TP 2 et donc plus de substrat peut être transformé par minute ?
La formule qui donne la vitesse v étant v = concentration ONP/temps x = (absorbance ONP/epsilon)/temps x, la seule chose qui change entre le TP 1 et 2 c'est donc la concentration en ONP apparu et le temps x (la réaction tourne 7 minutes au lieu de 3 minutes 30 secondes). Et pour le TP 2 j'ai une absorbance beaucoup plus grande, ce qui explique la vitesse beaucoup plus grande malgré l'inhibiteur et donc je ne comprends pas (plus de 9 UI contre 1,3 UI environ pour le dernier tube en les comparant tous les deux).
Eh bien tu as là un parfait exemple de problème de comparaison de données qui ne sont pas comparables.
Tu as l'expression de \( v = k_{cat} \times [ES] \) et \( [ES] = \frac{[E]_0}{1+ \frac {K_m}{[S]_0}} \) . Si tu rajoutes de l'inhibiteur alors Km est modifié comme on l'a dit, mais de l'autre côté si tu rajoutes des enzymes alors [ES] augmente. Si tu combines les deux effets, tu ne peux rien dire a priori des résultats ; la seule chose que tu puisses faire c'est calculer le Km et vérifier que tout marche bien. En revanche le Vmax va être multiplié dans les mêmes proportions que l'augmentation de la concentration en enzyme. (Cf ce qu'on disait plus haut, toujours se débrouiller pour travailler dans les mêmes conditions expérimentales sinon les données brutes sont inexploitables).
C'est même parfaitement logique : si tu augmentes la concentration d'enzymes c'est comme si tu augmentais la main d'oeuvre
employée pour construire un bâtiment : même si tu leur tires un peu dans les pattes (inhibiteurs) la vitesse globale de construction sera plus grande.
Si tu veux retomber sur tes pattes, calcule le kcat dans les deux cas (Vmax/[E]0) et vérifie qu'ils sont égaux, où à défaut du même ordre de grandeur. C'est cette donnée là qui est une constante caractéristique de l'enzyme, pas le Vmax, qui dépend et de cette constante et de la concentration en enzyme. Et le Km doit augmenter.
Je vois, mon hypothèse était donc correcte. Je ne vois pas pourquoi on a changé la concentration en enzyme entre les deux TP alors puisque le but est de conclure sur le type d'inhibition (donc voir si c'est Km ou Vmax qui varie ou si c'est les deux pour les inhibitions mixtes par exemple).
Bon pour ce TP je sais que c'est une inhibition compétitive puisque le glucose du maltose a de fortes chances d'être un analogue structural du galactose de l'ONPG (voir ci-dessus), j'ai aussi eu confirmation.
Mais normalement pour vraiment conclure sur le type d'inhibition je voulais montrer que Km augmente mais Vmax reste inchangé, ici ce sera donc impossible entre les deux TP à cause de la concentration en enzyme qui varie.
D'ailleurs à la fin du TP 1 j'ai aussi une partie influence de la concentration en enzyme (avec une concentration fixe en substrat cette fois-ci) et là j'ai des absorbances de plus en plus grandes à mesure qu'on augmente la concentration en enzyme. Donc je peux sans doute, dans le TP 2, lier cette partie du TP 1 en rappelant l'impact de la concentration en enzyme ?
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