Salut tout le monde!

j'ai besoin de votre aide, j'ai 3 partiel ce mercredi…

dont un de biologie moléculaire, seulement voilà me manque une petite partie de cours sur la mutagènese dirigée : la "méthode des 4 oligos"

le poly n'explique pas très bien, et je n'aimerais pas ne pas pouvoir répondre a une question concernant cela --'

si quelqu'un peut m'éxpliquer, meme cite fait, ou si vous avez un lien intéressant ça serait sympa

merci

wallaby

Salut,

Je ne connais pas de méthode de ce nom-là, mais je pense qu’il s’agit probablement de la méthode que je connais sous le nom de « mutagenèse par PCR chevauchante ». Si tel est le cas, je vais essayer de l’expliquer.

Soit le schéma suivant :

(Peu importe les noms, c’est un vieux schéma que je recycle.)

À gauche, la séquence codante d’un gène que l’on veut muter en y insérant une séquence étrangère. À droite, le résultat souhaité. La séquence étrangère (en rouge, marquée « TEV ») fait 21 nucléotides, et est donc trop longue pour être insérée par mutagenèse dirigée « classique » (deux oligos complémentaires, contenant la mutation à insérer et utilisés pour amplifier le vecteur entier).

L’approche de PCR chevauchante consiste à utiliser 4 amorces pour trois réactions de PCR successives : deux amorces flanquantes (T7PROM et BGHREV dans le cas présent), et deux amorces qui s’hybrident immédiatement avant (CTEV-) et après (CTEV+) le point où l’on veut insérer la mutation ; ces deux dernières amorces portent à leur extrémité 5’ la séquence à insérer (en rouge).

Les deux premières réactions de PCR se font avec les amorces T7PROM et CTEV- d’un côté, et CTEV+ et BGHREV de l’autre. Les produits de PCR obtenus sont respectivement la partie gauche et la partie droite du gène, chacune portant à une extrêmité la séquence étrangère.

Dans la troisième réaction de PCR, on va utiliser ces deux produits à la fois comme matrice et comme amorce pendant les 5 ou dix premiers cycles : ils vont s’hybrider au niveau de la séquence rouge qu’ils ont en commun, et la polymérase va donc synthétiser un produit couvrant toute la longueur du gène. On amplifie alors ce produit dans les vingt derniers cycles, en ajoutant les amorces flanquantes. Ne reste plus ensuite qu’à cloner classiquement le produit final.

J’espère que c’est assez clair. Le plus délicat à saisir est ce qui se passe au début de la troisième PCR. Schématise les produits des deux premières réactions pour bien comprendre comment ils peuvent interagir et comment la polymérase peut les amplifier.

Attention, quelques erreurs ! Une mutagénèse dirigée, c'est insérer une mutation ponctuelle dans une séquence d'ADN. Donc, c'est muter une base par une autre (u à la rigueur quelques unes) dans le but, généralement, de changer le codon et l'acide aminé correspondant.



(1) Supposons que l'on veuille créer une mutation ponctuelle dans le milieu d'une séquence, à la position marquée "*"

(2) On peux utiliser 4 oligonucléotides : 2 flanquants la séquence et 2 couvrant et introduisant la mutation.

(3) On effectue 2 réactions PCR pour obtenir les 2 moitiés du produt final et on les combine dans une troisième réaction en utilisant les 2 oligonucléotides des extrémités pour générer un produit chimérique.

(4) Cela est possible durant la PCR : le côté droit de la première molécule peut servir d'oligo pour le côté gauche de la seconde molécule.

Et enfin, on peut digérer le produit de PCR par EcoRI et BamHI (dans l'exemple) pour l'insérer dans le vecteur, à la place de l'original.


Voilà ce que l'on appelle la mutagénèse dirigée avec la méthode "4 oligos", et 2 PCR successives.

Attention donc, une mutagénèse dirigée n'est pas la bonne technique pour créer des protéine fusion en insérant des séquences d'intérêt (comme la TEV dans l'exemple de gouttegd, séquence de coupure à la protéase TEV, nécessaire pour séparer la protéine d'intérêt de son étiquette de purification).

@ humantarget : Je ne vois aucune différence avec ce que j’ai expliqué (toutefois ton schéma est plus approprié, merci). La taille de la mutation insérée (que ce soit un nucléotide ou une vingtaine) ne change strictement rien au principe.

Quand au fait que ce ne soit « pas une bonne technique » pour insérer un site TEV… c’est une technique qui fonctionne, qu’est-ce que tu veux de plus ?

Je veux dire par là que le terme "mutagénèse dirigée" convient plus à une mutation ponctuelle d'une ou deux bases plutôt qu'une séquence de plusieurs codons.

Ce que tu montre révèle plus du génie génétique et de l'insertion de séquence codante que de la mutagénèse dirigée. Mais, j'en conviens, l'idée reste la même...

Citation : humantarget

Je veux dire par là que le terme "mutagénèse dirigée" convient plus à une mutation ponctuelle d'une ou deux bases

C’est effectivement, me semble-t-il, la définition historique de « mutagenèse dirigée », mais je la trouve inutilement restrictive, puisqu’aujourd’hui, avec exactement la même méthode, on peut aussi bien :
– muter une ou plusieurs bases ;
– insérer une ou plusieurs bases (y compris plusieurs dizaines) ;
– déléter une ou plusieurs bases (y compris plusieurs dizaines).

La méthode étant la même dans tous les cas, je ne vois pas de raison de restreindre son nom à la définition du seul premier cas.

(On me signale dans l’oreillette que nous chipotons sur un point de détail )

Tout à fait Thierry mais ceci ne nous regarde pas...

Je pense que nous avons répondu à ma la question initiale, reste plus qu'à Wallaby777 de passer le sujet au vert ! Et on lui souhaite bonne chance pour ces partiels !

Merci pour vos réponse rapide, c'est super sympa

mais me reste juste une question, je crois que c'est plus de la curiosité qu'autre chose ,mais on sait jamais…

si on prend la premiere réponse, de gouttegd
pour les premieres pcr, on utilise l'oligonucléotide a gauche de 5'-3' (T7 prom)
et un autre au milieu comportant la mutation qu'on veut ajouter… (CTEV-)

lors de la synthèse, je comprend pas pourquoi tout le brin n'est pas synthétisé a partir de T7-prom, pourquoi on a une partie a gauche et une partie a droite?^^'

Citation : wallaby777

lors de la synthèse, je comprend pas pourquoi tout le brin n'est pas synthétisé a partir de T7-prom, pourquoi on a une partie a gauche et une partie a droite?^^'

Deux facteurs vont limiter l’élongatin du brin synthétisé à partir de T7-prom.

D’abord, la durée programmée de l’étape d’élongation. Les polymérases recombinantes utilisées classiquement pour ce genre de réactions ont une vitesse d’élongation d’environ 1 000 nucléotides par minute. Donc, si le fragment que l’on veut amplifier (ici, entre T7-prom et CTEV-) fait, disons, 600 nucléotides de long, on programmera une étape d’élongation de une minute maximum : assez longtemps pour être sûr que la polymérase a le temps de synthétiser le fragment requis, pas trop longtemps pour ne pas synthétiser inutilement des fragments trop longs (et gaspiller des nucléotides au passage).

Ensuite et surtout, le fait que rapidement, après les premiers cycles, les produits d’élongation vont devenir largement majoritaires par rapport à la matrice initiale. Ainsi, au dixième cycle, une amorce T7-prom aura beaucoup plus de chance de s’hybrider sur un fragment synthétisé à partir de CTEV- que sur le vecteur de départ ; l’élongation s’arrêtera alors automatiquement à l’extrémité 5’ de ce fragment.

Au final, à la fin de la PCR, le produit ultra-majoritaire sera un fragment borné entre T7-prom et CTEV-. Il y aura certes, également, des produits un peu plus longs (issus des premiers cycles), mais qui seront en quantité négligeable.

merci beaucoup^^

le problème est résolu maintenant^^

bonjour,

Je ne comprends pas comment vous obtenez les résultats  avec les amorces CTEV- et T7PROM  

es t ce que T7PROM  ne bouge pas est ce une amorce de bornage qui ne s 'hybride pas ?

Merci pour votre réponse car j'ai un DM   et ne trouve pas la solution 

bonjour,

Je ne comprends pas comment vous obtenez les résultats  avec les amorces CTEV- et T7PROM  

es t ce que T7PROM  ne bouge pas est ce une amorce de bornage qui ne s 'hybride pas ?

Merci pour votre réponse car j'ai un DM   et ne trouve pas la solution 

bonsoir tous le monde ma question est comment éliminé le brin matrice qui ne contiens pas la mutation??!