J'étais persuadé qu'on pouvait, ils font comment pour synthétiser des gènes rapporteurs etc. alors (donc plus de 20 bases j'imagine) ? Ou bien ils ne les synthétisent pas et les prennent in-vivo pour les remettre dans une autre cellule ?
Par de novo j'entendais vraiment à partir de rien, aucune matrice initiale, au laboratoire de chimie. D'ailleurs je crois me souvenir que la méthode employyée fait la synthèse en 3' - 5 ' parce que c'est plus simple mais ça reste néanmoins difficile : il faut protéger les bases tout en protégeant et déprotégeant correctement au bon moment les riboses et phosphates ; tu ajoutes les nucléotides 1 par 1, tu fais les traitements dessus qu'il faut. EN théorie c'est génial en pratique ça coûte cher et ça foire parce que les chaînes ne son pas forcément allongées toutes correctement donc tu te retrouves avec des fragments lésés. Et plus la longueur est grande et plus tu accumules les erreurs, c'est logique.
Du coup on s'en sert principalement pour la synthèse des amorces pour PCR.
Par contre en ce qui concerne les gènes rapporteurs, bah on le récupère depuis l'organisme, on les duplique en masse pour pas les perdre et après une des techniques utilisés c'est de le placer sur un plasmide bourré de sites de restriction, tu insères le gène à rapporter en aval du gène rapporteur en commençant par ouvrir le plasmide au bon endroit, tu as fais les manips qui faut pour qu'il y ait complémentarité entre le gène inséré et le plasmide ouvert et tu relis via des ligases. Résultat : le gène est lié à un rapporteur.
Après pour la synthèse de plus grandes séquences, y'a la PCR. ET tu peux jouer sur les amorces pour mettre un petit motif de signal pour différentes enzymes de restriction ou autres. Mais t'as besoin d'une matrice (et t'es limité aussi par la fiabilité de la PCR, en gros éviter plus de 1 ou 2 kpb).
Ok je vois, par contre comment est récupéré le gène rapporteur depuis l'organisme, genre pour la méduse (GFP) ? On extrait l'ADN mais après je ne vois pas comment on peut récupérer pile le gène qui nous intéresse, j'imagine qu'on découpe avec une enzyme de restriction mais je ne sais pas comment l'enzyme détecte où il faut couper sur un aussi grand génome d'eucaryote.
Et je ne savais pas qu'on pouvait mettre des plasmides dans une cellule eucaryote, puisque les plasmides ne se rencontrent que chez les bactéries (à part la levure du boulanger). Si on veut faire une fusion transcriptionnelle/traductionnelle chez un eucaryote par exemple.
Ok je vois, par contre comment est récupéré le gène rapporteur depuis l'organisme, genre pour la méduse (GFP) ? On extrait l'ADN mais après je ne vois pas comment on peut récupérer pile le gène qui nous intéresse, j'imagine qu'on découpe avec une enzyme de restriction mais je ne sais pas comment l'enzyme détecte où il faut couper sur un aussi grand génome d'eucaryote.
Historiquement j'ignore comment ça a été fait ; aujourd'hui y'a des outils beaucoup plus précis pour faire des coupures que les enzymes de restriction, type meganucleases ou protéines recombinantes qui intègrent des domaines de fixation à l'ADN (récupérés depuis des facteurs de transcription) et un domaine de coupure --> accroître la spécificité. Mais bon, c'est des travaux issus après des mois ou années de recherche, les laboratoires/industriels qui ont fabriqué les plasmides dont je te parlais ont du galéré et investir beaucoup d'argent. ET une fois que c'est fait, bah y'a plus qu'à le faire produire en masse.
Et je ne savais pas qu'on pouvait mettre des plasmides dans une cellule eucaryote, puisque les plasmides ne se rencontrent que chez les bactéries (à part la levure du boulanger). Si on veut faire une fusion transcriptionnelle/traductionnelle chez un eucaryote par exemple.
Mea culpa, j'ai oublié de préciser que je parlais dans le cas de procaryotes. chez les eucaryotes, bah maintenant onn peut grâce aux techniques modernes de coupure cibler la zone (en croisant bien les doigts) et venir faire ses bidouilles. Dans tous les cas fabriquer un mutant gène rapporteur ça prend du temps, d'autant plus que la maturité sexuelle arrive tard (pour donner une idée, une souris mutante KO c'est 3-4 ans, pour des mouches faudrait peut-être quelques semaines).
Et aussi, on peut passer par la technique du plasmide d'aabord pour l'introduire chez des bactéries pour faire reproduire l'ADN recombinant, puis récupérer le plasmide, rouvrir pour récupérer le système génétique et après l'utiliser. C'est long, ça prend du temps, mais ça se fait.
En effet ce n'est pas très clair, je vais essayer de m'exprimer plus clairement.
J'avais entendu dire que quand des scientifiques modifiaient un gène pour faire un OGM, ils mettaient en guise de "copyright" un morceau de texte comme un poème qu'ils inséraient dans le gène pour prouver que le gène était leur propriété. Et je me suis demandé comment était il possible de d'insérer un morceau de texte ou même de modifier un gène dans une molécule.
On utilise un synthétiseur d'ADN qui consiste à mettre bout à bout les bases A, T G et C (dans l'ordre désiré )... c'est juste des réactions chimiques qui ont été automatisées ! Une fois l'ADN synthétisé ont l'insert dans un vecteur bactérien ou viral pour l'introduire dans une plante ou l'animal c'est simple à faire mais faut pas faire n'importe quoi !!!
C'est sur que il ne faut pas faire n'importe quoi #moutonméduse ^^:)
ATtention à un point : les journaux ont cherché à défrayer la chronique avec un titre provocateur "Des agneaux méduses !!", sous-entendu les scientifiques font n'importe quoi. Evidemment ce qu'on ne précise pas parce que sinon c'est pas drôle c'est que c'est juste une protéine de marquage hyper courante, qui fait juste de la fluorescence verte, et qu'on a trouvé chez une méduse. Et aussi ça prend trop de place. Mais la protéine récupérée chez la méduse, la GFP, est juste une technique hyper courante en recherche et parfaitement encadrée ; c'est un peu l'analogue en biologie moléculaire des antibio pous soigner les infections bactériennes.
Et puis comme ça ça fait une raison de plus au grand public pour détester les OGM, avec en première ligne l'idée encore répandue que "si on bouffe de l'OGM on va muter aussi alors non aux OGM"
(Bon après ça soulève des problèmes d'encadrements des mutants, et comment ils ont pu sortir des laboratoires, etc... Mais c'est pas tout à fait la même problématique).
Après je crois bien qu'il est possible de rendre l'animal fluorescent tout entier, j'ai vu des photos. Mais il faut que la transfection soit faite sur le zygote normalement, sinon pas toutes les cellules exprimeront la protéine. D'ailleurs je me demande comment ils font pour la faire exprimer partout (ou au moins sur la peau) puisque je ne sais pas comment ils pourraient contrôler les modifications épigénétiques du gène GFP qu'ils ont introduit et qui empêcheraient la transcription du gène, de plus ce n'est pas un gène naturel chez l'animal modifié...
D'ailleurs je me demande comment ils font pour la faire exprimer partout
Tu places la séquence codante sous le contrôle d'un promoteur fort. Après tout quitte à faire dans l'OGM autant faire des gènes recomposés (type promoteur d'ARN ribosomique, de tubuline, d'histone, peu importe). L'épigénétique peut jouer ensuite aussi évidemment et diminuer ou augmenter l'expression du gène mais rarement l'éteindre complètement (sauf exceptions exceptionnelles type inactivation du chromosome X où là le X inactivé peut plus rien faire, ou si tu as visé de l'hétérochromatine). Mais bon tu prévois correctement ton coup, et si jamais ça foire et bah tant pis ça arrive (fréquemment) et tu recommences jusqu''à pouvoir présenter le résultat. (Et un peu de mauvaise foi en masquant tous les ratés en prime)
(ou au moins sur la peau)
Bah là faut récupérer un promoteur d'un gène plus ou moins spécifique de la peau. La je dirais la kératine, y'aura des faux positifs dans l'expression de la GFP mais a priori clairement la peau serait la principale zone d'expression.
EDIT : à yy repenser à deux fois c'est pas sûr que ce soit la meilleure idée. Mais on peut imaginer des constructions génétiques très originales à base de système cre lox pour que l'enzyme Cre ne soit activé que par des facteurs de différenciation de la peau par exemple (faudrait consulter des documents d'embryo pour trouver le candidat et son promoteur associé les plus adéquats) et comme ça pouf ça devrait marcher (modulo les ratés, comme d'habitude).
ce n'est pas un gène naturel chez l'animal modifié
Attention, là tu pars un peu dans le "les OGM ça peut pas marcher puisqu'on prend un bout d'ADN pour le mettre dans un organisme totalement différent". Les mécanismes d'expression des gènes sont les mêmes chez tous les Eucaryotes (on pourrait dire chez tous les organismes vivants mais les eucaryotes ont leurs propres spécificités par rapport aux autres, mais que tous les Eucaryotes ont). Résultats des courses : la séquence protéique sera la même (mêmes introns excisés, etc..., et à exception près évidemment). Les seules différences notables sont les modifications post-traductionnelles, ajout de lipides ou de glucides si la protéine doit passer par là.
Mais dans le cas de la GFP tout va très bien c'est une séquence très courte (de mémoire environ 60 aa) qui n'a pas besoin d'être modifiée, c'est la séquence peptidique directement qui va s'automodifier pour créer le fluorophore vert (et en prime on peut facilement s'en servir pour faire de la protéine fusion, son repliement ne perturbe quasiment pas celui de la protéine "hôte").
"L'épigénétique peut jouer ensuite aussi évidemment et diminuer ou augmenter l'expression du gène mais rarement l'éteindre complètement"
Dans ce cas comment se fait la régulation in-vivo ? Je croyais que l'épigénétique suffisait à contrôler à elle seule totalement l'expression d'un gène (au niveau transcriptionnel je parle). Quel autre phénomène permet alors d'éteindre complètement un gène au niveau transcriptionnel (donc sans parler des miARN etc.) ? J'avais pensé à l'absence d'un facteur de transcription spécifique dans tel tissu et donc tel gène ne sera pas exprimé dans tous les tissus mais pas sûr du tout.
Et pour en revenir au sujet de la GFP si j'ai bien compris utiliser un promoteur d'un gène ubiquitaire (càd exprimé dans tous les tissus) permet alors de faire exprimer la GFP dans tous les tissus ? Pour cela il faut le faire depuis le zygote j'imagine ?
Si on veut le faire exprimer que dans la peau il faut trouver un promoteur d'un gène spécifiquement exprimé dans la peau ça j'ai compris. Par contre je me suis toujours demandé comment se faisait la spécificité, je veux dire pourquoi tel gène sera exprimé dans la peau et un autre non ? Je sais que c'est dû à l'absence de facteur de transcription spécifique pour le gène non exprimé (normalement, cf question 1) mais ce que je ne comprends pas c'est comment se fait la reconnaissance spécifique du promoteur par ce facteur de transcription spécifique, pourquoi initie-t-il la transcription du gène exprimé et pas celle de tous les gènes puisqu'a priori les promoteurs sont identiques pour tous les gènes ?
La TATA box est la même partout (sauf quelques modifications des fois) et les promoteurs ont les mêmes séquences nucléotidiques, je ne pense pas que ce soit le promoteur qui soit spécifique d'un gène mais peut-être les séquences régulatrices en amont du promoteur (enhancer/silencer) ? Si oui cela implique que tous les gènes aient des séquences régulatrices ?
"Les mécanismes d'expression des gènes sont les mêmes chez tous les Eucaryotes"
J'imagine donc que transférer un gène d'eucaryote vers un procaryote cette fois-ci serait impossible ? Puisque les procaryotes n'ont pas d'introns (à part les introns autocatalytiques) et que si on transfère un gène avec introns d'eucaryote alors ce dernier ne pourrait subir d'épissage adéquat chez le procaryote ?
"et en prime on peut facilement s'en servir pour faire de la protéine fusion, son repliement ne perturbe quasiment pas celui de la protéine "hôte" "
Je me demandais justement si la GFP perturbait le repliement de la protéine avec laquelle il est fusionné et tu as très bien répondu.
J'ai vérifié et selon wiki ce serait même pire : la GFP faciliterait le repliement de la protéine à laquelle il est fusionné.
Dans ce cas comment se fait la régulation in-vivo ? Je croyais que l'épigénétique suffisait à contrôler à elle seule totalement l'expression d'un gène (au niveau transcriptionnel je parle). Quel autre phénomène permet alors d'éteindre complètement un gène au niveau transcriptionnel (donc sans parler des miARN etc.) ? J'avais pensé à l'absence d'un facteur de transcription spécifique dans tel tissu et donc tel gène ne sera pas exprimé dans tous les tissus mais pas sûr du tout.
Oh oui mince tu as raison, dans ma tête j'étais parti uniquement dans le cas des promoteurs forts qui snt juste un peu régulés parce qu'ils sont forts, mais pour tous les autres gènes bien sûr que ça jouer, compaction en hétérochromatine, sélection du programme génétique, facteurs de transcriptions, et cie... Ouh que je me serais fait tuer !
Sinon les facteurs de transcription ne sont pas forcément positifs, d'autres peuvent également éteindre l'expression (pas compliqués, on se fixe sur la séquence et on n'en part pas, ça fait barrrage). Tu peux avoir un exemple avec les inhibiteurs de la transcription de l'opéron lactose.
(GFP) Pour cela il faut le faire depuis le zygote j'imagine ?
Je sais pas comment ça marche, mais sûrement que oui, en tout cas si c'est fait après ce sera une chimère - c'est pas forcément un mal, mais bon - ou alors chez les parents. L'essentiel c'est que ça marche.
ce que je ne comprends pas c'est comment se fait la reconnaissance spécifique du promoteur par ce facteur de transcription spécifique, pourquoi initie-t-il la transcription du gène exprimé et pas celle de tous les gènes puisqu'a priori les promoteurs sont identiques pour tous les gènes ?
Attention non. Tous les promoteurs ne sont pas les mêmes (encore heureux !). Pour commencer, tous les gènes n'ont pas de TATAA box (chez la droso, environ 1/3 seulement). Un promoteur ça englobe tout pleins de régions régulatrices , avec parfois des séquences situés après le +1 de transcription. Pour donner un ordre de grandeur ça peut remonter à -200 et aller jusqu'à +30, +50...
Le promoteur s'étend sur bien avant le site d'initiation. Avec tout ça ça laisse le champ libre à de nombreux facteurs de transcriptions. Après tu rajoutes les enhancers ou silencers, avant ou après le site, à qqs centaines jusqu'à milliers de nucléotides.
Si oui cela implique que tous les gènes aient des séquences régulatrices ?
Oh, globalement oui. Enfin j'imagine. Mais c'est très souvent le cas.
J'imagine donc que transférer un gène d'eucaryote vers un procaryote cette fois-ci serait impossible ? Puisque les procaryotes n'ont pas d'introns (à part les introns autocatalytiques) et que si on transfère un gène avec introns d'eucaryote alors ce dernier ne pourrait subir d'épissage adéquat chez le procaryote ?
Bah disons que c'est possible, maiis t'auras les introns ^^. À part ça la séquence codante sera a peu près la même, sauf la méthionine de départ qui sera peut-être pas gérée tout à fait de la même façon (aucune idée de ce que ça peut donner, à voir), peut-être les acides aminés rares pyrrolysine et sélénocystéine qui pointeront le bout de leur nez - ou différemment - et des différences sur les modifications post-traductionnelles.
Mais pour les introns on peut tricher, tu fait de la RT-PCR sur l'ARNm ciblé, t'obtiens la séquence ADN épurée des introns, et t'en fais ce que tu veux.
Pour en rajouter, on a pour l'instant le problème qu'il faut exploser la molécule initiale pour la lire (on leur fait plein de magouilles entre amplification de la quantité initiale et coupures en courts fragments). Y'a des machines de lecture de 3è génération qui pourront peut-être passer outre cette étape mais elles sont pas encore au point.
Sauf que pour faire ça faut décongéler l'ADN - puisqu'il est conservé à -18°C - et le recopier, étape mutagène donc ça pose la question de la fiabilité. En attendant les coûts restent énormes pour la synthèse d'ADN artificiel, la lecture - plus c'est long plus ça coûte cher - donc ça rejoint un peu les trucs genre odrinateurs quantiques, absolument pas pour le grand public de toute façon, un intérêt théorique énorme mais de nombreuses difficultés et beaucoup de coûts en attendant. Même si ça n'en reste pas moins intéressant pour autant, quelque part.
"Attention non. Tous les promoteurs ne sont pas les mêmes (encore heureux !). Pour commencer, tous les gènes n'ont pas de TATAA box (chez la droso, environ 1/3 seulement). Un promoteur ça englobe tout pleins de régions régulatrices , avec parfois des séquences situés après le +1 de transcription. Pour donner un ordre de grandeur ça peut remonter à -200 et aller jusqu'à +30, +50..."
Ah d'accord j'étais loin.
Si je reprends : le promoteur c'est la séquence TATA où se fixe l'ARN pol II + des séquences régulatrices (silencers ou enhancers) + des nucléotides dont on s'en fout (façon de parler) (+ parfois le site +1 et un peu après) ?
Pour le promoteur englobant des séquences après le site +1 et jusqu'à +50 je ne savais pas, pour moi ça s'arrêtait forcément plusieurs nucléotides avant le site +1. Alors ça veut dire que parfois une partie du promoteur est transcrite ? Mais le promoteur est toujours en amont du AUG sur l'ARNm (donc 5' ATG 3' sur l'ADN) et ne le dépassera jamais ça c'est sûr ?
Je crois que les gènes d'ARNt et ARNr 5S transcrits par l'ARN pol III ont effectivement une partie du promoteur transcrite.
"Mais pour les introns on peut tricher, tu fait de la RT-PCR sur l'ARNm ciblé, t'obtiens la séquence ADN épurée des introns, et t'en fais ce que tu veux."
Super technique je n'y avais pas pensé.
Donc on obtient le cDNA sans les introns, sans le promoteur, sans la région non traduite en 5' et sans la région non traduite en 3'. Ce qui fait qu'on n'a pas la totalité du gène (ça dépend si dans la définition du gène on englobe le promoteur et les régions non-traduites). J'imagine que ça ne pose pas problème et qu'ensuite si on veut réinsérer tout ça dans le génome procaryote on n'a qu'à "recoller" ensemble promoteur + région non-traduite en 5' + cDNA + région non-traduite en 3' ?
Par contre vu que c'est un gène d'eucaryote mais qu'on le met dans un génome procaryote, à la place de la TATA box dans le promoteur il faudrait remettre la boîte de Pribnow pour que ça marche ? Et dans la région non-traduite en 5' juste avant le codon d'initiation, il faudrait mettre la séquence shine-dalgarno à la place de celle de Kozak ?
Bon par contre après aucune idée de comment tout ça se fait en labo (y'a des histoires d'enzymes de restriction mais c'est tout ce que je sais), j'essaye déjà de bien comprendre la théorie avant la pratique.
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